許昌市眾誠(chéng)絕緣材料有限公司

Invitrogen核/膜系統(tǒng)
一、 實(shí)驗(yàn)原理：
酵母雙雜交系統(tǒng)是在酵母體內(nèi)通過重建有活性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)來鑒定蛋白質(zhì)之間的相互作用。轉(zhuǎn)錄因子可以和DNA上特異的序列結(jié)合而啟動(dòng)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。這種DNA結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由轉(zhuǎn)錄因子上兩個(gè)相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BindingDomain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(ActivationDomain，AD)分別來完成的，并且這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄激活都是必須的。在GAL4系統(tǒng)中利用轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD與激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，分別與基因的ORFs融合，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在酵母內(nèi)表達(dá)的蛋白若發(fā)生相互作用時(shí)，就會(huì)將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，西安淳風(fēng)生物科技有限公司，淳風(fēng)生物科技，激活相應(yīng)報(bào)告基因的表達(dá)，在相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性。酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建是篩庫(kù)的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大規(guī)模篩選分析蛋白質(zhì)間的相互作用，是現(xiàn)在分子生物學(xué)與生物化學(xué)常用的手段。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：
1.1  RNA提取

1.2  mRNA分離

1.3  cDNA初級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建
1.3.1cDNA第一鏈的合成
1.3.2cDNA第二鏈的合成
1.3.3cDNAadapter的制備
1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5cDNA分級(jí)分離
1.3.6BP重組
1.3.7電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.3.8文庫(kù)克隆檢測(cè)
1.3.9文庫(kù)庫(kù)容量、重組率、插入片段長(zhǎng)度鑒定

1.4  cDNA次級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建
1.4.1初級(jí)文庫(kù)的質(zhì)粒抽提
1.4.2LR重組
1.4.3電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.4.4文庫(kù)克隆檢測(cè)
1.4.5文庫(kù)庫(kù)容量、重組率、插入片段長(zhǎng)度鑒定

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
次級(jí)文庫(kù)庫(kù)容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。
Invitrogen核/膜系統(tǒng)
一、 實(shí)驗(yàn)原理：
酵母雙雜交系統(tǒng)是在酵母體內(nèi)通過重建有活性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)來鑒定蛋白質(zhì)之間的相互作用。轉(zhuǎn)錄因子可以和DNA上特異的序列結(jié)合而啟動(dòng)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。這種DNA結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由轉(zhuǎn)錄因子上兩個(gè)相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BindingDomain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(ActivationDomain，AD)分別來完成疒的，并且這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄激活都是必須的。在GAL4系統(tǒng)中利用轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD與激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，分別與基因的ORFs融合，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在酵母內(nèi)表達(dá)的蛋白若發(fā)生相互作用時(shí)，就會(huì)將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報(bào)告基因的表達(dá)，在相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性。酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建是篩庫(kù)的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大規(guī)模篩選分析蛋白質(zhì)間的相互作用，是現(xiàn)在分子生物學(xué)與生物化學(xué)常用的手段。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：
1.1  RNA提取

1.2  mRNA分離

1.3  cDNA初級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建
1.3.1cDNA第一鏈的合成
1.3.2cDNA第二鏈的合成
1.3.3cDNAadapter的制備
1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5cDNA分級(jí)分離
1.3.6BP重組
1.3.7電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.3.8文庫(kù)克隆檢測(cè)
1.3.9文庫(kù)庫(kù)容量、重組率、插入片段長(zhǎng)度鑒定

1.4  cDNA次級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建
1.4.1初級(jí)文庫(kù)的質(zhì)粒抽提
1.4.2LR重組
1.4.3電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.4.4文庫(kù)克隆檢測(cè)
1.4.5文庫(kù)庫(kù)容量、重組率、插入片段長(zhǎng)度鑒定

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
次級(jí)文庫(kù)庫(kù)容大于107，重組率大于90閂%，平均插入片段大于1kb。
Invitrogen核/膜系統(tǒng)
一、 實(shí)驗(yàn)原理：
酵母雙雜交系統(tǒng)是在酵母體內(nèi)通過重建有活性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)來鑒定蛋白質(zhì)之間的相互作用。轉(zhuǎn)錄因子可以和DNA上特異的序列結(jié)合而啟動(dòng)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。這種DNA結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由轉(zhuǎn)錄因子上兩個(gè)相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BindingDomain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(ActivationDomain，AD)分別來完成的，并且這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄激活都是必須的。在GAL4系統(tǒng)中利用轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD與激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，分別與基因的ORFs融合，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在酵母內(nèi)表達(dá)的蛋白若發(fā)生相互作用時(shí)，就會(huì)將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報(bào)告基因的表達(dá)，.淳風(fēng)生物科技___r石家莊酵母雙雜交文庫(kù)實(shí)驗(yàn)
，在相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性。酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建是篩庫(kù)的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大規(guī)模篩選分析蛋白質(zhì)間的相互作用，是現(xiàn)在分子生物學(xué)與生物化學(xué)常用的手段。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：
1.1  RNA提取

1.2  mRNA分離

1.3  cDNA初級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建
1.3.1cDNA第一鏈的合成
1.3.2cDNA第二鏈的合成
1.3.3cDNAadapter的制備
1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5cDNA分級(jí)分離
1.3.6BP重組
1.3.7電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.3.8文庫(kù)克隆檢測(cè)
1.3.9文庫(kù)庫(kù)容量、重組率、插入片段長(zhǎng)度鑒定

1.4  cDNA次級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建
1.4.1初級(jí)文庫(kù)的質(zhì)粒抽提
1.4.2LR重組
1.4.3電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.4.4文庫(kù)克隆檢測(cè)
1.4.5文庫(kù)庫(kù)容量、重組率、插入片段長(zhǎng)度鑒定

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
次級(jí)文庫(kù)庫(kù)容大于107，.淳風(fēng)生物科技___r石家莊酵母雙雜交文庫(kù)實(shí)驗(yàn)
，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。

.淳風(fēng)生物科技___r石家莊酵母雙雜交文庫(kù)實(shí)驗(yàn)