許昌市眾誠(chéng)絕緣材料有限公司

Invitrogen核/膜系統(tǒng)
一、 實(shí)驗(yàn)原理：
真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA—bindingdomain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因彳子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS)，而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過(guò)程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用。在GAL4系統(tǒng)中構(gòu)建與基因的ORFs融合的激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD融合構(gòu)建載體，分別轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在酵母內(nèi)表達(dá)的蛋白若與順式作用元件發(fā)生相互作用時(shí)，就會(huì)將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報(bào)告基因的表達(dá)，在相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性?；蜣D(zhuǎn)錄實(shí)際上是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動(dòng)子區(qū)各種順式作用元件相互作用的結(jié)果，這種結(jié)合猶如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質(zhì)互作的基礎(chǔ)。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：
1.1  RNA提取

1.2  mRNA分離

1.3  cDNA初級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建
1.3.1cDNA第一鏈的合成
1.3.2cDNA第二鏈的合成
1.3.3cDNAadapter的制備
1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5cDNA分級(jí)分離
1.3.6BP重組
1.3.7電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.3.8文庫(kù)克隆檢測(cè)
1.3.9文庫(kù)庫(kù)容量、重組率、插入片段長(zhǎng)度鑒定

1.4  cDNA次級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建
1.4.1初級(jí)文庫(kù)的質(zhì)粒抽提
1.4.2LR重組
1.4.3電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.4.4文庫(kù)克隆檢測(cè)
1.4.5文庫(kù)庫(kù)容量、重組率、插入片段長(zhǎng)度鑒定

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
次級(jí)文庫(kù)庫(kù)容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。Invitrogen核/膜系統(tǒng)
一、 實(shí)驗(yàn)原理：
真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA—bindingdomain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS)，而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過(guò)程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用。在GAL4系統(tǒng)中構(gòu)建與基因的ORFs融合的激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD融合構(gòu)建載體，分別轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在酵母內(nèi)表達(dá)的蛋白若與順式作用元件發(fā)生相互作用時(shí)，就會(huì)將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，西安淳風(fēng)生物科技有限公司，淳風(fēng)生物科技，激活相應(yīng)報(bào)告基因的表達(dá)，在相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性?；蜣D(zhuǎn)錄實(shí)際上是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動(dòng)子區(qū)各種順式作用元件相互作用的結(jié)果，這種結(jié)合猶如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質(zhì)互作的基礎(chǔ)。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：
1.1  RNA提取

1.2  mRNA分離

1.3  cDNA初級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建
1.3.1cDNA第一鏈的合成
1.3.2cDNA第二鏈的合成
1.3.3cDNAadapter的制備
1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5cDNA分級(jí)分離
1.3.6BP重組
1.3.7電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.3.8文庫(kù)克隆檢測(cè)
1.3.9文庫(kù)庫(kù)容量、重組率、插入片段長(zhǎng)度鑒定

1.4  cDNA次級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建
1.4.1初級(jí)文庫(kù)的質(zhì)粒抽提
1.4.2LR重組
1.4.3電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.4.4文庫(kù)克隆檢測(cè)
1.4.5文庫(kù)庫(kù)容量、重組率、插入片段長(zhǎng)度鑒定

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
次級(jí)文庫(kù)庫(kù)容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。Invitrogen核/膜系統(tǒng)
一、 實(shí)驗(yàn)原理：
真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA—bindingdoma忄in，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS)，.淳風(fēng)生物科技|||烏魯木齊酵母單雜交文庫(kù)實(shí)驗(yàn)
，而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過(guò)程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用。在GAL4系統(tǒng)中構(gòu)建與基因的ORFs融合的激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD融合構(gòu)建載體，分別轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在酵母內(nèi)表達(dá)的蛋白若與順式作用元件發(fā)生相互作用時(shí)，.淳風(fēng)生物科技|||烏魯木齊酵母單雜交文庫(kù)實(shí)驗(yàn)
，就會(huì)將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報(bào)告基因的表達(dá)，在相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性?；蜣D(zhuǎn)錄實(shí)際上是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動(dòng)子區(qū)各種順式作用元件相互作用的結(jié)果，這種結(jié)合猶如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質(zhì)互作的基礎(chǔ)。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：
1.1  RNA提取

1.2  mRNA分離

1.3  cDNA初級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建
1.3.1cDNA第一鏈的合成
1.3.2cDNA第二鏈的合成
1.3.3cDNAadapter的制備
1.3.4cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份)
1.3.5cDNA分級(jí)分離
1.3.6BP重組
1.3.7電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B
1.3.8文庫(kù)克隆檢測(cè)
1.3.9文庫(kù)庫(kù)容量、重組率、插入片段長(zhǎng)度鑒定

1.4  cDNA次級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建
1.4.1初級(jí)文庫(kù)的質(zhì)粒抽提
1.4.2



.淳風(fēng)生物科技|||烏魯木齊酵母單雜交文庫(kù)實(shí)驗(yàn)