廣州輝駿生物科技股份有限公司

一．Pulldown的概念

       在Pulldown實(shí)驗(yàn)中，帶標(biāo)簽的誘餌蛋白能被特異結(jié)合該標(biāo)簽的固相親和配基捕獲，形成“次級(jí)親和支持物”，用于純化與誘餌蛋白相互作用的其他蛋白。純化產(chǎn)物洗脫后，經(jīng)Westernblot驗(yàn)證或LC-MS/MS，即可證明或鑒定與誘餌蛋白互作的蛋白。

二．Pulldown實(shí)驗(yàn)流程

                                                                          圖1.Pulldown流程示意圖

三．Pulldown實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)
1、構(gòu)建含His或GST標(biāo)簽的誘餌蛋白原核表達(dá)載體；
2、原核表達(dá)誘餌蛋白（我們采用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌，能有效降低包涵體的形成）；
3、細(xì)菌裂解液過柱，帶標(biāo)簽的誘餌蛋白被固相化親和配基捕獲，產(chǎn)生“次級(jí)親和支持物”；
4、待測(cè)樣品裂解液過柱孵育，與誘餌蛋白互作的蛋白被“次級(jí)親和支持物”吸附；
5、清洗，離心，去除未結(jié)合的雜蛋白；
6、洗脫，得到誘餌蛋白及其互作蛋白的復(fù)合物；
7、如要驗(yàn)證某蛋白X與誘餌蛋白互作，則將6.所得的蛋白復(fù)合物與X蛋白的抗體孵育，做Westernblot驗(yàn)證即可；
8、如要尋找誘餌蛋白可能的互作蛋白，則需將6.所得的蛋白復(fù)合物做LC-MS/MS鑒定；
圖2.Pulldown實(shí)驗(yàn)流程圖

四．生物信息學(xué)分析GO注釋統(tǒng)計(jì)
 
                                                    
 Pathway分析

五．Pulldown實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)內(nèi)容
1、原核表達(dá)載體構(gòu)建；
2、融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化；
3、pulldown捕獲互作蛋白；
4、Westernblot驗(yàn)證或LC-MS/MS鑒定互作蛋白；
5、數(shù)據(jù)檢索、生物信息學(xué)分析；
6、結(jié)果分析與報(bào)告整理。